کاربرد روشهای کشت درون شیشه ای (Invitro) در به نژادی گیاهان دگرگشن

اصطلاح کشت درون شیشه ای در برگیرنده کلیه روشهای کشت سلول، بافت و اندام گیاهی در ظروف شفاف و در شرایط استریل می‌باشد. هر سلول گیاهی در شرایط مناسب کشت می‌تواند رشد نماید و بصورت یک گیاه کامل درآید. در بهره برداری از این پتانسیل ژنی در گیاهان دو هدف عمده دنبال می‌شود:

1- تولید و تکثیر انبوه گیاهان یکنواخت

2- دستیابی به صفات جدید

برنامه های کشت درون شیشه ای در به نژادی گیاهان دگرگشن

کلیه روشهای کشت سلول بافت و اندام گیاهی شامل کشت‌های : سوسپانسیون سلولی، کالوس و پروتوپلاست برای کلیه گیاهان قابل پیش بینی است و مورد بهره برداری قرار می گیرند. مهمترین کاربردهای کشت بافت گیاهی در به نژادی گیاهان دگرگشن از جمله چغندرقند موارد زیر می‌باشد:

1- کلونینگ یا ریز ازدیادی برای ازدیاد غیر جنسی سریع پایه های والد و هیبریدهای آنها

2- هاپلودیپلوئیدیزاسیون برای تولید لاینهای هموزیگوت برای ژنهای مطلوب (اکثرا مغلوب)

3- کشت جنین برای نجات جنین هیبرید بین گونه ای یا خلاصه نمودن چرخه رشد گیاه

کلیات کشت بافت گیاهی

نیازهای غذایی و عوامل رشد در شرایط کشت "درون شیشه ای"

یکی از مهمترین عوامل تعیین کننده موفقیت کشت بافت گیاهی انتخاب صحیح محیط غذایی است. محلول غذایی شامل اجزای اصلی و اختیاری است. مواد غذایی اصلی نمکهای معدنی، منبع انرژی یا کربن، ویتامین ها و مواد تنظیم کننده رشد گیاهی می‌باشند. استفاده از مواد آلی مانند انواع قندهای لاکتوز، گالاکتوز و عصاره های گیاهی مهم اما اختیاری است.

نمکهای معدنی متناسب با یونهای مورد نیاز گیاه انتخاب و ترکیب می‌گردند. یونهای عناصر پر مصرف در غلظت میلی مول شامل ازت، پتاسیم، فسفر، کلسیم، گوگرد و منیزیم و عناصر کم مصرف اما مهم در غلظت میکرومول شامل آهن، منگنز، روی، بر، کبالت و مولیبدن می‌باشند.

برای ازدیاد رویشی، منبع انرژی کربن معمولاً در غلظت 2 تا 3 درصد در محیط غذایی گنجانده می‌شود. کمپلکس ویتامین‌هایB و ویتامینCمعمولاً بیشتر در محیط‌های کشت به کار می‌روند. انتخاب یک محیط غذایی برای کشت بافت یک گیاه ویژه با استفاده از الگوهای غذایی آزمون شده آغاز می‌شود و برطبق نیازهایی که مشاهده می‌گردد تغییرات کمی و کیفی در آن انجام می‌شود تا با شرایط رشد آن گیاه تطبیق داده شود. معمولاً الگوهای نخست یکی از محیط‌های شناخته شده مانند موراشیگ واسکوگ (MS)یا محیط غذایی گامبورگ  (B5)می‌باشد.

روشهای ریز ازدیاد کلونی

ریز ازدیاد کلونی گیاهان در شرایط کشت "درون شیشه" شامل موارد زیر می‌باشد:

تولید جوانه‌های جانبی در بافت‌های مریستمی

تولید جوانه‌های نابه‌جا پس از القاء بافت مریستمی

جنین زایی سوماتیکی

الف- تولید جوانه‌های جانبی

1- کشت مریستم

کشت مریستم گیاه بمنظور زدودن آلودگی‌ها بویژه آلودگی ویروسی و تولید هسته کلونی سالم به اجرا در می‌آید و شامل برداشت ریز نمونه ای حداکثر بطول یک میلی متر از ناحیه مریستمی ساقه گیاه است. اندازه ریز نمونه برداشت شده از اهمیت زیادی برخوردار است، زیرا برای حفظ سلامت گیاهی که باززایی می‌شود بهترین اندازه ریز نمونه 0/25 میلی متر می‌باشد، در حالیکه موفقیت استقرار و رشد ریز نمونه‌های بزرگتر از این اندازه بیشتر است، اما خطر باقی ماندن عوامل آلودگی افزایش می‌یابد.

2- کشت بخش انتهایی ساقه

کشت بخش انتهایی ساقه شامل بخش بزرگتری از منطقه در حال رشد و مریستمی است. در این روش ممکن است نمونه بین 10-1 میلی متر مورد بهره برداری قرار گیرد. در این روش جوانه‌های جانبی از مریستم‌های موجود و مستعد شده در ریز نمونه تولید می‌گردند و نمونه‌های باززایی شده از ثبات ژنی بالایی برخوردار می‌باشند. ریز نمونه مریستمی از گیاهچه بذری و نیز گیاه کامل قابل کشت می‌باشد.

ب- تولید جوانه‌های نابه‌جا

کشت بافت غیر مریستمی

کشت بافت ساختمانی گیاه شامل برگ، لپه، دمبرگ، ساقه و ریشه منشاء تولید بافت کالوس و ایجاد جوانه‌های نابه‌جا می‌باشند. در این روش نقاط مریستمی تولید کننده جوانه‌های نابه‌جا باید بوسیله عوامل موثر در محیط کشت غذایی و شرایط رشد القا گردند. این روش ازدیاد به دلیل گذر از فاز کالزایی می‌تواند موجب تغییر در مجموعه ژنی بافت اولیه گردد. گیاهان باززایی شده با این روش، معمولاً باید از نظر شناسایی تفاوت‌های احتمالی ایجاد شده در مقایسه با بافت اولیه کنترل شوند.

پ- تولید جنین سوماتیکی

ایجاد شرایط برای باززایی جنین کامل از بافت گیاهی یکی از جدیدترین روشهای ازدیاد کلونی معرفی شده که بدلیل سرعت تولید و تعداد زیاد نمونه‌های تولید شده و استفاده احتمالی آن بعنوان بذر مصنوعی برای گیاهان زراعی از اهمیت زیادی برخوردار گشته است.

جنین‌های سوماتیک یا رویشی شباهت زیادی به جنین‌های زیگوتی یا زایشی دارند. این بافتها به علت اینکه دارای کلیه اندام‌های رشد: مریستم ساقه و مریستم ریشه می‌باشند نیاز به مراحل متعدد تولید مانند شرایط باززایی و رشد به روش اندام زایی مرحله‌ای ندارند. دوره کوتاه‌تر تولید در این روش از امتیازات مهم آن است. در این سیستم باززایی گیاهی، در صورت استفاده از بافت مریستم برای آغاز کشت، ثبات ژنی بافت اولیه پایدار می‌ماند. این روش با وجود سهولت اجرا نیاز به فن آوری پیشرفته‌تر نسبت به روش‌های دیگر داشته و پیش بینی می کنند که در آینده جایگزین روش‌های ریز ازدیادی رایج خواهد گردید.

هاپلودیپلوئیدیزاسیون در چغندرقند

 مهمترین مواد اولیه برای ایجاد هاپلوییدی، گامت‌های گیاه می‌باشند. دو روش اصلی شامل کشت درون شیشه دانه گرده یا بساک و کشت درون شیشه سلول تخم در کیسه جنینی است. در چغندرقند روش دوم امکان پذیر است.

پارتنوژنز یا ماده زایی

تولید گیاهان دیپلویید از کشت تخمک و تخمدان گیاه در شرایط درون شیشه برای بسیاری از گیاهان مهم زراعی امکان پذیر است. سلول‌های کیسه جنینی قادر به تولید جنین و یا بافت هاپلویید در شرایط درون شیشه هستند.

ارزش این روش در گیاهان زراعی چون چغندر که از روش آندروژنز به نتیجه نمی‌رسد از اهمیت زیادی برخوردار است. یکی از مهمترین مسایل در تولید گیاهان از طریق کشت سلول‌های کیسه جنینی، تعیین منشا بافت جنین است. کالوس و یا جنین‌های حاصل ممکن است از سلول‌های گامتوفیتی و یا اسپوروفیتی بطور خود به خود ایجاد گردد. اگر تعداد کروموزوم‌های هاپلوئید در سلول‌های گیاهان باززایی شده قابل شمارش باشد امکان تمایز سلول‌هایی که منشا متفاوت دارند امکان پذیر است. در صورت ایجاد گیاهان دیپلویید منشا این گیاهان در نتاج آنها معلوم می‌گردد. این ابهام با تحقیقات انجام شده برطرف شد و در سال 1993 نشان داده شد که منشا گیاهان باززایی شده در کشت درون شیشه، بافت تخمک سلول تخمزا است، زیرا سلول‌های سینرژید دچار از هم پاشیدگی شده و گیاهان دیپلویید احتمالی ایجاد شده در کشت‌های متوالی جنین اولیه، معمولاً در اثر دو برابر شدن خود به خود کروموزوم‌های بافت هاپلویید بوجود می‌آیند. برنامه کشت شامل دو مرحله القا جنین و رشد گیاهچه می باشد. این بررسی‌ها نشان داد که در بسیاری از موارد جنین به گیاه کامل و نرمال تبدیل می‌شود و در برخی موارد انتقال‌های متوالی به محیط جدید ضروری است.

کشت جنین و کاربردهای آن

کشت جنین عبارت از جدا کردن یک جنین بالغ یا نابالغ استریل در شرایط این ویترو است که هدف از آن تولید یک گیاه زنده است. مهمترین کاربردهای کشت جنین عبارتند از:

1- تولید هیبریدهای کمیاب: مفیدترین کاربرد کشت جنین بدست آوردن هیبریدهای کمیاب است. در بسیاری از تلاقی‌های بین گونه‌ای و بین جنسی لقاح بطور طبیعی انجام شده اما بدلیل نمو غیر طبیعی یا ناچیز آندوسپرم، جنین قبل از بلوغ از بین می‌رود و دانه‌های قابل رویش تولید نخواهد شد. حل این مشکل با کشت جنین امکان پذیر می‌باشد.

2- تولید گیاهان هاپلویید: در تلاقی Hordum vulgare و H.bulbosome، لقاح انجام شده اما کروموزوم‌های گونه bulbosome در مراحل اولیه از بین می‌روند. این جنین هاپلویید تنها با کشت جنین می‌تواند به حیات خود ادامه دهد.

3- کوتاه نمودن دوره اصلاح گیاه: در تعداد زیادی از گونه‌های گیاهی (به علت دوره طولانی خواب دانه که اغلب ناشی از پوسته بذر یا آندوسپرم است) با کشت جنین می‌توان سرعت جوانه زنی را افزایش و طول این دوره را کاهش داد. مثلاً دوره زندگی زنبق از طریق این روش به کمتر از یک سال کاهش یافته است.

4- ازدیاد گیاهان نادر: دانه‌های Musa balbisiana گونه وحشی موز و یک رقم نارگیل با نام Makapumo که در حالت طبیعی قادر به جوانه زنی نمی‌باشد با استفاده از این تکنیک جوانه زده و به گیاه تبدیل می‌شوند.

نجات جنین

اصطلاح نجات جنین تنها به مواردی محدود  می‌شود که جنین‌ها اگر نجات داده نشوند در معرض خطر بوده و به گیاهچه تبدیل نمی‌شوند. این حالت وقتی جنین‌ها بطور ارثی ضعیف بوده یا نتیجه تلاقی دور هستند، رخ می‌دهند.

هیبریداسیون بین گونه‌ای و بین جنسی، معمولاً به علت عدم لقاح، مرگ جنین یا قطع ارتباط آندوسپرم با جنین با شکست مواجه می‌شود. در این نوع هیبریداسیون ممکن است مطلقاً بذری تشکیل نشود یا تعداد اندکی تشکیل شود که اغلب بی شکل با نقص آندوسپرم و احتمالاً فاقد قدرت حیاتی است. در این موارد تکنیک نجات جنین ارزشمند بوده و انجام تلاقی‌های مشکل و یا حتی غیر ممکن با این روش میسر شده است. در این روش جنین قبل از نابود شدن در شرایط این ویترو کشت و نگهداری می‌شود.

فاکتورهای موثر در کشت جنین

تولید یک گیاه کامل از جنین در شرایط این ویترو به عوامل متعددی بستگی دارد که اجمالاً عبارتند از: ژنوتیپ، مرحله نمو جنین در هنگام جداسازی، شرایط رشد گیاه مادری و ترکیب محیط کشت.

نیازهای محیط کشت جنین

صرف نظر از نمک‌های معدنی که ترکیبات ضروری هستند وجود ترکیبات محرک رشد در محیط غذایی ضروری است. برخی از آنها عبارتند از:

قندها: قند اصولاً منبع تأمین انرژی می‌باشد و معمول‌ترین قند بکار رفته ساکارز است که علاوه بر تأمین کربن، تثبیت کننده فشار اسمزی نیز می‌باشد. اگرچه گلوکز و فروکتوز و همچنین مانوز و گلیسرول نیز گاهی نتایج خوبی نشان داده‌اند. اهمیت ایجاد فشار اسمزی توسط غلظت بالای ساکارز از اهمیت غذایی آن بیشتر است. همچنین جنین‌های نارس نیاز به فشار اسمزی بالاتری نسبت به جنین‌های بالغ دارند. جنین‌های بالغ معمولاً در غلظت 2 تا 3 درصد ساکارز، رشد می‌کنند. در حالیکه جنین‌های نابالغ در غلظت‌های بالاتر ساکارز(8 تا 12 درصد) بهتر رشد می‌کنند.

مکمل‌های طبیعی: اکثر مکمل‌ها در کشت جنین منشا آندوسپرمی دارند. شیره نارگیل که آندوسپرم مایع است بطور گسترده در کشت جنین استفاده شده است. اثرات مثبت عصاره‌های آندوسپرمی بر کشت جنین‌های تعدادی از گونه‌های گیاهی گزارش شده است. اگرچه ترکیبات شیمیایی آندوسپرم گونه‌های متفاوت گیاهی با هم اختلاف دارند ولی معمولاً شامل میوانیوزیتول، سوربیتول، اکسین‌ها، سیتوکینین‌ها، ترکیبات نیتروژنی و غیره است. ظاهراً وجود گلوتامین برای رشد جنین‌های نابالغ ضروری است.

آگار: غلظت آگار بین 0/6 و 0/8 درصد در نظر گرفته می‌شود. غلظت‌های بالاتر مانع رشد می‌شوند.

تنظیم کننده‌های رشد: اگرچه تنظیم کننده‌های رشد از قبیل اسید جیبرلیک، اکسین‌ها و سیتوکینین‌ها بطور گسترده استفاده می‌شوند اما اثرات آنها ناپایدار و بعضاً متناقض است. این ترکیبات اثر تغذیه‌ای نداشته و احتمالاً فعالیت آنها تا اندازه‌ای باعث نفوذ پذیری سلول و جذب یون‌ها می‌شود. بطور کلی غلظت اکسین و سیتوکینین رشد نرمال جنین را بهبود داده در حالیکه غلظت بالای آن اثرات منفی داشته و یا باعث رشد کالوس‌های سازمان نیافته در جنین کشت شده می‌شود. در بعضی موارد جیبرلین باعث تسریع رشد جنین می‌شود، مخصوصاً در هنگامی‌ که دوره خواب وجود دارد.

 اکسیژن: این عامل اهمیت زیادی دارد و به نظر می‌رسد در بعضی موارد نیاز کشت جنین به اکسیژن بیش از غلظت موجود در هوا است.

دما، pH و نور: اگرچه گزارشهایی مبنی بر تأثیر این عوامل محیطی بر رشد جنین وجود دارد اما تعیین مجموعه مشخصی از این شرایط برای جنین‌های گروه معینی از گیاهان آسان نیست، اما با این حال جالب توجه است که بدانیم جنین‌ها نیازهای غذایی و رویشی والدین خود را منعکس می‌کنند. بطور کلی جنین‌های جدا شده از گیاهان زمستانی در مقایسه با گیاهان تابستانی، نیاز به درجه حرارت پایین‌تری دارند.

حد طبیعیpH محیط کشت برای رشد جنین بسیاری از گیاهان 5-6 ماه است. همچنین در چند روز اول کشت( 7 الی 14 روز) از نور پرهیز می‌شود چون ممکن است جوانه زنی پیش رس را القا کند. پس از آن بمنظور تشکیل کلروفیل، در روشنایی قرار می‌گیرند.

بیوراکتور گیاهی

یکی از جنبه‌های بیوتکنولوژی کاربردی، ریز ازدیادی گیاهان در شرایط این ویترو است. تکنیک‌های رایج که براساس فعالیت‌های تحقیقاتی شکل گرفته‌اند، شامل تعداد زیادی ظروف کشت کوچک، محیط کشت جامد و نیمه جامد و تکثیر دستی بافت گیاهی در شرایط استریل است. بنابراین هزینه‌های تولید بالا بوده و موجب محدود شدن ریزازدیادی تجاری گردیده است.

بسیاری از محققین بر این باورند که اگر هزینه تولید کاهش یابد، امکان تکثیر گیاهان با این روش افزایش فوق‌العاده‌ای خواهد داشت. بخش اعظم هزینه‌های جاری تولید، بخصوص در کشورهای پیشرفته مربوط به دستمزد می‌باشد که برآورد شده چهل تا شصت درصد آنرا شامل می‌شود. بسیاری از آزمایشگاه‌ها مشغول تحقیق روی این مسئله هستند که چگونه می‌توان با کاهش تعداد دفعات واکشت، هزینه تولید را پایین آورد.

استفاده از ظروف کشت بزرگ و محیط کشت مایع از طریق دستگاه‌های بیوراکتور گیاهی می‌تواند به مکانیزه کردن ریز ازدیادی و کاهش هزینه آن کمک کند.

استفاده از بیوراکتور در تکثیر گیاهان اولین بار در سال 1981 برای بگونیا گزارش شد. در ایران برای اولین بار استفاده از بیوراکتور گیاهی برای تکثیر بهینه گیاهان میخک و آناناس و سیب زمینی و همچنین گیاه موز گزارش گردیده است.

ساختمان و روش کار بیوراکتور

اجزاء یک بیوراکتور گیاهی شامل موارد زیر می‌باشد:

زمان سنج، پمپ هوا، میکروفیلتر ( با قطر و روزنه 0/22 میکرون)، ظروف کشت، ظرف محیط کشت، لوله‌های نقل و انتقال هوا و لوله‌های نقل و انتقال مواد غذایی.

نحوه کارکرد بیوراکتور به این صورت است که پمپ هوا طبق برنامه داده شده به زمان سنج روشن شده و با عبور هوا از فیلتر تعبیه شده موجب ایجاد فشار در ظرف مواد غذایی می‌شود. این فشار هوا موجب انتقال مواد غذایی توسط لوله‌های مربوط به ظرف کشت شده و تا زمانی که پمپ روشن است نمونه گیاهی شناور بوده و در عین حال سیستم به نحوی طراحی شده که یکی از لوله‌ها در این مدت علاوه بر انتقال مواد غذایی، هوادهی ظرف کشت را نیز انجام داده و چون در این ظرف نیازی به اعمال فشار نیست، لوله‌ای برای خروج هوای اضافی نیز تعبیه شده است. با خاموش کردن پمپ توسط زمان سنج، مواد غذایی موجود در ظرف کشت به واسطه وجود اختلاف پتانسیل، بطور کامل به ظرف مواد غذایی بر می‌گردند.

منبع: جزوه کارگاه آموزشی بهنژادی، مقاله " کاربرد روش‌های کشت درون شیشه‌ای (Invitro) در به نژادی گیاهان دگرگشن" نویسندگان: نسرین یاوری و فرانک روزبه، برگزار کنندگان: موسسه تحقیقات اصلاح و تهیه بذر چغندرقند و معاونت آموزش و تجهیز نیروی انسانی- کرج 19 الی 20 خرداد 1382.